C.33.
Voortplantingstest met regenwormen (Eisenia fetida/Eisenia andrei)


[Inleiding

1

Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 222 (2004) van de OESO. De test is opgezet om de effecten van stoffen in de bodem op het voortplantingsresultaat (en andere subletale eindpunten) van de regenwormsoorten Eisenia fetida (Savigny 1826) en Eisenia andrei (Andre 1963) te beoordelen (1)(2). De test is onderworpen aan een ringtest (3). Er bestaat een testmethode voor de acute toxiciteitstest voor regenwormen (4). Er is ook een aantal andere internationale en nationale richtsnoeren voor acute en chronische tests voor regenwormen gepubliceerd (5)(6)(7)(8).

2

Eisenia fetida /Eisenia andrei worden beschouwd als vertegenwoordigers van bodemfauna en regenwormen in het bijzonder. Achtergrondinformatie over de ecologie van regenwormen en hun gebruik in ecotoxicologische tests is te vinden in (7)(9)(10)(11)(12).

Principe van de test

3

Volwassen wormen worden blootgesteld aan een concentratiebereik van de teststof die door de grond is gemengd of, in het geval van pesticiden, wordt aangebracht in of op de grond volgens procedures die overeenkomen met het gebruikspatroon van de stof. De wijze van aanbrengen is specifiek voor het doel van de test. Het bereik van testconcentraties wordt zo gekozen dat de concentraties die waarschijnlijk binnen een periode van acht weken zowel subletale als letale effecten zullen hebben, binnen het bereik vallen. De effecten op de mortaliteit en groei van de volwassen wormen worden na 4 weken blootstelling bepaald. De volwassen wormen worden dan uit de grond verwijderd, en na nog eens 4 weken worden de effecten op de voortplanting beoordeeld door het aantal nakomelingen te tellen dat in de grond aanwezig is. Het voortplantingsresultaat van de wormen die zijn blootgesteld aan de teststof, wordt vergeleken met dat van de controle(s) om het volgende te bepalen: (i) de concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen (no observed effect concentration, NOEC) en/of (ii) ECx (bv. EC10, EC50) door met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het voortplantingsresultaat met x %. De ECx (bv. EC10, EC50) moet in het bereik van de testconcentraties liggen, zodat de ECx kan worden bepaald door interpolatie in plaats van extrapolatie (zie aanhangsel 1 voor definities).

Informatie over de teststof

4

Over de teststof moeten de volgende gegevens beschikbaar zijn om passende testprocedures te helpen opzetten:
oplosbaarheid in water;
log Kow;
dampspanning;
en, indien mogelijk, informatie over het lot en het gedrag in het milieu (bv. fotolyse- en hydrolysesnelheid voor zover relevant voor aanbrengingspatronen).

5

Deze testmethode is van toepassing op alle stoffen, ongeacht hun oplosbaarheid in water. De testmethode is niet van toepassing op vluchtige stoffen, d.w.z. stoffen waarvoor de Henry-constante of de lucht/water-verdelingscoëfficiënt groter dan één is, of op stoffen waarvoor de dampspanning bij 25 °C groter dan 0,0133 Pa is.

6

In deze testmethode wordt geen rekening gehouden met mogelijke afbraak van de teststof in de loop van de test. Er kan dus niet worden aangenomen dat de blootstellingsconcentraties gedurende de gehele test hun beginwaarde behouden. Een chemische analyse van de teststof aan het begin en het eind van de test is in dat geval aanbevolen.

Referentiestof

7

De NOEC en/of de ECx van een referentiestof moeten worden bepaald om zekerheid te verkrijgen dat de testomstandigheden in het laboratorium toereikend zijn en om na te gaan dat de respons van de testorganismen in de loop van de tijd niet statistisch wijzigt. Het is raadzaam ten minste één keer per jaar of, wanneer de test met een vrij lage frequentie wordt uitgevoerd, tegelijk met de bepaling van de toxiciteit van een teststof een referentiestof te testen. Carbendazim of benomyl zijn geschikte referentiestoffen waarvan is aangetoond dat zij de voortplanting beïnvloeden (3). Er zouden significante effecten moeten worden waargenomen tussen (a) 1 en 5 mg werkzaam bestanddeel (w.b.)/kg droge massa of (b) 250-500 g/ha of 25-50 mg/m2. Indien in de testreeks een positieve toxische standaard wordt opgenomen, wordt één concentratie gebruikt en moet het aantal replicaten hetzelfde zijn als in de controles.

Geldigheid van de test

8

Wil een testresultaat geldig zijn, dan moet in de controlegroep aan de volgende criteria worden voldaan:
elk replicaat (10 volwassen wormen bevattende) moet aan het eind van de test ≥ 30 nakomelingen hebben voortgebracht;
de variatiecoëfficiënt van de voortplanting moet ≤ 30 % zijn;
de mortaliteit van volwassen wormen in de eerste 4 weken van de test moet ≤ 10 % zijn.
Wanneer een test niet aan de hierboven genoemde geldigheidscriteria voldoet, moet de test worden beëindigd, tenzij voortzetting van de test kan worden gemotiveerd. De motivering dient in het verslag te worden opgenomen.

Beschrijving van de test

Benodigdheden

9

Er moeten testvaten worden gebruikt die van glas of een ander chemisch inert materiaal gemaakt zijn en een inhoud hebben van een tot twee liter. De vaten moeten een oppervlakte van de doorsnede van circa 200 cm2 hebben, zodat een vochtige substraatdikte van ongeveer 5-6 cm wordt bereikt wanneer 500 tot 600 g droge massa substraat wordt toegevoegd. De afsluiting van de vaten moet zo zijn ontworpen dat uitwisseling van gassen tussen het substraat en de lucht mogelijk is en licht wordt doorgelaten (bv. door middel van een geperforeerd transparant deksel), maar wordt voorkomen dat de wormen ontsnappen. Als de gebruikte hoeveelheid testsubstraat substantieel meer is dan 500 tot 600 g per testvat, moet het aantal wormen proportioneel worden verhoogd.

10

Een standaard-laboratoriumuitrusting is vereist, in het bijzonder:
droogkast;
stereomicroscoop;
pH-meter en fotometer;
geschikte nauwkeurige weegschalen;
adequate apparatuur voor temperatuurregeling;
adequate apparatuur voor vochtigheidsregeling (niet noodzakelijk als de blootstellingsvaten een deksel hebben);
incubator of kleine kast met klimaatregelaar;
pincet, haken of ogen;
waterbad.

Bereiding van de kunstmatige grond

11

In deze test wordt een kunstmatige grond gebruikt (5)(7) met de volgende samenstelling (gebaseerd op drooggewicht, gedroogd tot een constant gewicht bij 105 °C):
10 % veenmosturf (de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen, gedroogd tot gemeten vochtgehalte);
20 % kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet);
0,3 tot 1,0 % calciumcarbonaat (CaCO3, verpulverd, analytisch zuiver) om een beginwaarde van de pH te verkrijgen van 6,0 ± 0,5.
70 % luchtdroog kwartszand (afhankelijk van de benodigde hoeveelheid CaCO3), overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 micron hebben.
Noot 1: De benodigde hoeveelheid CaCO3 zal afhangen van de bestanddelen van het grondsubstraat inclusief voeding en moet worden bepaald door metingen van gronddeelmonsters direct vóór de test. De pH wordt gemeten in een gemengd monster in een 1 M-oplossing van kaliumchloride (KCl) of een 0,01 M-oplossing van calciumchloride (CaCl2) (13).
Noot 2: Het gehalte organische koolstof van de kunstmatige grond kan worden verlaagd, bv. door vermindering van het turfgehalte tot 4-5 % en dienovereenkomstige verhoging van het zandgehalte. Door een dergelijke verlaging van het gehalte organische koolstof kan de adsorptie van de teststof aan de grond (organische koolstof) afnemen en kan de beschikbaarheid van de teststof voor de wormen toenemen. Aangetoond is dat Eisenia fetida kan voldoen aan de geldigheidscriteria voor de voortplanting bij tests in veldgrond met een lager gehalte organische koolstof (bv. 2,7 %) (14), en de ervaring leert dat dit ook bereikt kan worden in kunstmatige grond met 5 % turf. Het is daarom niet nodig om vóór het gebruik van een dergelijke grond in een definitieve test aan te tonen dat de kunstmatige grond geschikt is om aan de geldigheidscriteria te voldoen, tenzij het turfgehalte tot onder het hierboven genoemde gehalte wordt verlaagd.
Noot 3: Wanneer in aanvullende tests (bv. van de latere fasen) natuurlijke grond wordt gebruikt, moet eveneens worden aangetoond dat de grond geschikt is en dat wordt voldaan aan de geldigheidscriteria.

12

De droge bestanddelen van de grond worden in een goed geventileerde ruimte grondig gemengd (bv. in een grote laboratoriummenger). Vóór aanvang van de test wordt de droge kunstmatige grond bevochtigd door genoeg gedeïoniseerd water toe te voegen om ongeveer de helft van het uiteindelijke watergehalte te verkrijgen, d.w.z. 40 % tot 60 % van het maximale waterhoudend vermogen (overeenkomend met 50 ± 10 % vochtgehalte van de droge massa). Dit levert een substraat op dat geen staand of vrij water heeft wanneer het in de hand wordt geknepen. Het maximale waterhoudend vermogen (WHV) van de kunstmatige grond wordt bepaald overeenkomstig de procedures als beschreven in aanhangsel 2, ISO 11274 (15) of een gelijkwaardige EU-norm.

13

Als de teststof zonder water op het grondoppervlak wordt aangebracht of met de grond wordt gemengd, kan de uiteindelijke hoeveelheid water in de kunstmatige grond worden gemengd tijdens de bereiding van de grond. Als de teststof met water door de grond wordt gemengd, kan de aanvullende hoeveelheid water tezamen met de teststof worden toegevoegd (zie punt 19).

14

Het vochtgehalte van de grond wordt aan het begin en aan het eind van de test bepaald overeenkomstig ISO 11465 (16) of een gelijkwaardige EU-norm, en de pH-waarde van de grond wordt bepaald overeenkomstig aanhangsel 3 of ISO 10390 (13) of een gelijkwaardige EU-norm. Deze bepalingen moeten worden uitgevoerd in een monster controlegrond en een monster van elke testconcentratiegrond. De pH-waarde van de grond mag niet worden aangepast wanneer zure of basische stoffen worden getest. Het vochtgehalte moet gedurende de gehele test worden bewaakt door de vaten periodiek te wegen (zie de punten 26 en 30).

Selectie en voorbereiding van de proefdieren

15

De testsoort is Eisenia fetida of Eisenia andrei (1)(2). Om de test te beginnen zijn volwassen wormen tussen twee maanden en één jaar oud met een clitellum nodig. De wormen moeten worden gekozen uit een gesynchroniseerde cultuur met een relatief homogene leeftijdsstructuur (aanhangsel 4). Individuele wormen in een testgroep mogen in leeftijd niet meer dan 4 weken van elkaar verschillen.

16

De geselecteerde wormen moeten gedurende ten minste één dag worden geacclimatiseerd met het type kunstmatig grondsubstraat dat in de test zal worden gebruikt. Tijdens deze periode moeten de wormen worden gevoed met hetzelfde voedsel dat in de test zal worden gebruikt (zie de punten 31 tot en met 33).

17

Aan het begin van de test moeten groepen van 10 wormen afzonderlijk worden gewogen en moeten de groepen aselect worden toegewezen aan de testvaten. De wormen worden vóór het wegen gewassen (met gedeïoniseerd water), en het overtollige water wordt verwijderd door de wormen kort op filterpapier te leggen. De natte massa van de afzonderlijke wormen moet tussen 250 en 600 mg zijn.

Bereiding van testconcentraties

18

Voor het aanbrengen van de teststof kunnen twee methoden worden gebruikt: menging van de teststof in de grond (zie hiervoor de punten 19-21) of aanbrenging op het grondoppervlak (zie hiervoor de punten 22-24.). De keuze van de juiste methode hangt af van het doel van de test. In het algemeen wordt aangeraden de teststof door de grond te mengen. Het kan echter nodig zijn aanbrengingsprocedures te gebruiken die overeenkomen met de normale landbouwpraktijk (bv. sproeien van vloeibare formulering of gebruik van speciale formuleringen van pesticiden zoals granulaten of zaadbehandelingen). Oplosmiddelen die als hulpstof worden gebruikt bij de behandeling van de grond met de teststof, moeten worden gekozen op basis van hun laag toxisch effect op regenwormen, en er moet een geschikte oplosmiddelcontrole in de testopzet worden opgenomen (zie punt 27).

Mengen van de teststof in de grond

In water oplosbare teststof

19

Vlak voor het begin van de test wordt een oplossing van de teststof in gedeïoniseerd water bereid in een hoeveelheid die voldoende is voor alle replicaten van één concentratie. Er kan een co-solvent nodig zijn om het bereiden van de testoplossing te vergemakkelijken. Het is handig om voldoende oplossing te bereiden om het uiteindelijke vochtgehalte (40 tot 60 % van het maximale waterhoudend vermogen) te bereiken. De oplossing wordt goed vermengd met het grondsubstraat voordat dit naar een testvat wordt overgebracht.

In water onoplosbare teststof

20

De teststof wordt opgelost in een kleine hoeveelheid geschikt organisch oplosmiddel (bv. aceton) en vervolgens op een kleine hoeveelheid fijn kwartszand gesproeid of erdoorheen gemengd. Het oplosmiddel wordt daarna verwijderd door het gedurende tenminste enkele minuten in een afzuigkast te verdampen. Vervolgens wordt het behandelde zand goed gemengd met de vooraf bevochtigde kunstmatige grond. Daarna wordt gedeïoniseerd water toegevoegd, in een hoeveelheid die nodig is om een uiteindelijke vochtigheidsgraad van 40 tot 60 % van het maximale waterhoudend vermogen te bereiken, en door de grond gemengd. De grond is daarna gereed om naar de testvaten te worden overgebracht. Er dient op te worden gelet dat sommige oplosmiddelen een toxisch effect kunnen hebben op regenwormen.

In water en organische oplosmiddelen onoplosbare teststof

21

Er wordt een mengsel bereid bestaande uit 10 g fijngemalen industrieel kwartszand en een hoeveelheid van de teststof die nodig is om de testconcentratie in de bodem te bereiken. Vervolgens wordt het mengsel goed gemengd met de vooraf bevochtigde kunstmatige grond. Daarna wordt gedeïoniseerd water toegevoegd, in een hoeveelheid die nodig is om een uiteindelijke vochtigheidsgraad van 40 tot 60 % van het maximale waterhoudend vermogen te bereiken, en door de grond gemengd. De grond is daarna gereed om naar de testvaten te worden overgebracht.

Aanbrengen van de teststof op het grondoppervlak

22

De grond wordt behandeld nadat de wormen zijn toegevoegd. De testvaten worden eerst gevuld met het bevochtigde grondsubstraat, waarna de gewogen wormen op het oppervlak worden geplaatst. Gezonde wormen graven zich gewoonlijk onmiddellijk in het substraat in. Wormen die na 15 minuten nog op het oppervlak zijn achtergebleven, worden daarom als beschadigd beschouwd en moeten worden vervangen. Als wormen worden vervangen, moeten de nieuwe wormen en de vervangen wormen worden gewogen, zodat het totale levend gewicht van de blootstellingsgroep en het totale gewicht van het vat met wormen aan het begin bekend is.

23

De teststof wordt aangebracht. De teststof mag niet binnen een half uur na de plaatsing van de wormen aan de grond worden toegevoegd (en evenmin als er wormen op het grondoppervlak aanwezig zijn), om directe blootstelling aan de teststof door contact met de huid te vermijden. Wanneer de teststof een pesticide is, kan het aangewezen zijn de teststof door sproeien op het grondoppervlak aan te brengen. De teststof moet zo gelijkmatig mogelijk op het grondoppervlak worden aangebracht met behulp van een geschikte laboratoriumsproeier om aanbrenging door sproeien in het veld te simuleren. Vóór aanbrenging dient het deksel van het testvat te worden verwijderd en te worden vervangen door een binnenkuip die de zijwanden van het vat beschermt tegen de spray. De binnenkuip kan worden gemaakt van een testvat waaruit de bodem is verwijderd. De aanbrenging dient te geschieden bij een temperatuur van 20 ± 2 °C en voor waterige oplossingen, emulsies of dispersies bij een wateraanbrenging van 600 tot 800 μl/m2. De verhouding moet worden gecontroleerd met een passende kalibratietechniek. Speciale formuleringen zoals granulaten of zaadbehandelingen moeten worden aangebracht op een wijze die overeenkomt met de landbouwpraktijk.

24

Testvaten moeten gedurende één uur onafgedekt blijven, zodat vluchtig oplosmiddel dat is gebruikt bij de aanbrenging van de teststof, kan verdampen. Er moet op worden gelet dat er in deze tijd geen wormen uit de testvaten ontsnappen.

Procedure

Test-en controlegroepen

25

Aanbevolen wordt een aantal van 10 regenwormen in 500 tot 600 g droge massa van de kunstmatige grond (d.w.z. 50-60 g grond per worm). Als grotere hoeveelheden grond worden gebruikt, zoals het geval kan zijn als pesticiden worden getest met speciale aanbrengingswijzen zoals zaadbehandelingen, moet de hoeveelheid van 50-60 g grond per worm worden aangehouden door het aantal wormen te vergroten. Voor elk controle- en behandelingsvat worden tien wormen voorbereid. De wormen worden met water gewassen en drooggeveegd en vervolgens kort op absorberend papier geplaatst, zodat overtollig water kan wegstromen.

26

Om systematische fouten in de verdeling van de wormen over de testvaten te voorkomen, moet de homogeniteit van de testpopulatie worden vastgesteld door 20 aselect gekozen wormen uit de populatie waaruit de testwormen zullen worden gehaald, afzonderlijk te wegen. Nadat de homogeniteit is gewaarborgd, worden met een randomiseringsprocedure batches van wormen samengesteld, gewogen en aan de testvaten toegewezen. Na plaatsing van de testwormen moet het gewicht van elk testvat worden bepaald, zodat het begingewicht bekend is en als basis kan dienen voor het gedurende de test bewaken van het vochtgehalte van de grond als beschreven in punt 30. De testvaten worden vervolgens afgesloten als beschreven in punt 9 en in de testruimte geplaatst.

27

Voor elk van de aanbrengingsmethoden van de teststof worden passende controles voorbereid als beschreven in de punten 18 tot en met 24. Voor de voorbereiding van de controles worden de beschreven toepasselijke procedures gevolgd, zij het dat geen teststof wordt gevoegd. Voor zover van toepassing worden dus organische oplosmiddelen, kwartszand of andere media op de controles aangebracht in concentraties/hoeveelheden die overeenkomen met die in de behandelingen. Wanneer een oplosmiddel of ander medium wordt gebruikt om de teststof aan te brengen, moet ook een extra controle zonder het medium of de teststof worden voorbereid en getest om te waarborgen dat het medium het resultaat niet beïnvloedt.

Testomstandigheden

28

De testtemperatuur is 20 ± 2 °C. De test wordt uitgevoerd bij gecontroleerde licht-donkercycli (bij voorkeur 16 uur licht en 8 uur donker), met een verlichting van 400 tot 800 lux in het gebied van de testvaten.

29

De testvaten worden tijdens de test niet belucht, maar het ontwerp van de afsluiting van de testvaten moet uitwisseling van gassen wel mogelijk maken, maar de verdamping van vocht beperken (zie punt 9).

30

Het watergehalte van het grondsubstraat in de testvaten wordt gedurende de hele test gehandhaafd door de testvaten (zonder hun afsluiting) periodiek opnieuw te wegen. Het verloren vocht wordt, indien nodig, aangevuld met gedeïoniseerd water. Het watergehalte mag niet meer dan 10 % afwijken van het gehalte aan het begin van de test.

Voeding

31

Elk voedsel van een kwaliteit waarvan is aangetoond dat het geschikt is om het gewicht van de wormen tijdens de test ten minste in stand te houden, wordt aanvaardbaar geacht. De ervaring leert dat havervlokken, koeien- of paardenmest geschikte voedselbronnen zijn. Er moeten controles plaatsvinden om te waarborgen dat koeien of paarden waarvan mest wordt verkregen, geen medicijnen gebruiken en niet worden behandeld met een chemische stof, zoals groeibevorderaars, nematiciden of soortgelijke diergeneesmiddelen die tijdens de test een negatief effect op de wormen zouden kunnen hebben. Het wordt aangeraden om zelfverzamelde koeienmest te gebruiken, want de ervaring leert dat commercieel verkrijgbare koeienmest die als meststof in tuinen wordt gebruikt, negatieve effecten op de wormen kan hebben. De mest moet vóór gebruik aan de lucht worden gedroogd, fijngemalen en gepasteuriseerd.

32

Elke verse batch voedsel moet, voordat de batch in een test wordt gebruikt, worden verstrekt aan een wormcultuur die geen deel uitmaakt van de test, om te waarborgen dat de batch van toereikende kwaliteit is. De groei en coconproductie mag niet lager zijn dan die van wormen die worden gehouden in een substraat dat de nieuwe batch voedsel niet bevat (voorwaarden als beschreven in testmethode C.8(4)).

33

Voedsel wordt voor het eerst verstrekt één dag na de plaatsing van de wormen en de aanbrenging van de teststof op de grond. Ongeveer 5 g voeding wordt over het grondoppervlak van elk vat verspreid en bevochtigd met gedeïoniseerd water (ongeveer 5 ml tot 6 ml per vat). Daarna wordt gedurende de testperiode van 4 weken één keer per week voedsel verstrekt. Als het voedsel niet volledig wordt opgegeten, moet de portie worden verkleind om schimmelgroei te voorkomen. De volwassen wormen worden op dag 28 van de test uit de grond verwijderd. Vervolgens wordt aan elk testvat nog eens 5 g voedsel toegediend. In de resterende 4 weken van de test wordt geen voeding meer verstrekt.

Selectie van testconcentraties

34

Wanneer er vooraf iets bekend is over de toxiciteit van de teststof, bijvoorbeeld uit een acute test (4) en/of bereikbepalingstests, kan dit nuttig zijn bij het kiezen van geschikte testconcentraties. Indien nodig, wordt een bereikbepalingstest uitgevoerd met bijvoorbeeld vijf teststofconcentraties van 0,1, 1,0, 10, 100 en 1000 mg/kg (drooggewicht grond). Eén replicaat voor elke behandeling en controle volstaat. De tijdsduur van de bereikbepa-lingstest is twee weken, en de mortaliteit wordt aan het eind van de test beoordeeld.

Proefopzet

35

Omdat voor de test niet één samenvattende statistiek kan worden voorgeschreven, voorziet deze testmethode in de bepaling van de NOEC en de ECx. In de nabije toekomst zal door regelgevende autoriteiten waarschijnlijk een NOEC worden geëist. Op grond van statistische en ecologische overwegingen kan in de nabije toekomst ook de ECx algemener worden gebruikt. Op basis van de aanbevelingen voortvloeiende uit een ringtest van een voortplantingstestmethode voor enchytreeën worden daarom drie opzetten voorgesteld (17).

36

Bij de vaststelling van het concentratiebereik moet aandacht worden geschonken aan het volgende:
Voor de bepaling van de NOEC moeten ten minste vijf/twaalf concentraties worden getest die een meetkundige reeks vormen. Aanbevolen wordt vier replicaten voor elke testconcentratie plus acht controles te gebruiken. De concentraties moeten worden gekozen met intervallen die onderling verschillen met een factor van niet meer dan 2,0.
Voor de bepaling van de ECx (bv. EC10, EC50) wordt aanbevolen voldoende concentraties te gebruiken om ten minste vier statistisch significant verschillende gemiddelde responsen op deze concentraties te veroorzaken. Aanbevolen wordt ten minste twee replicaten voor elke testconcentratie plus zes controles te gebruiken. De intervalsfactor kan variëren, d.w.z. kleiner dan of gelijk aan 1,8 in het verwachte effectbereik en groter dan 1,8 bij de hogere en lagere concentraties.
Een gecombineerde aanpak maakt het mogelijk om zowel de NOEC als ECx te bepalen. Er moeten acht behandelingsconcentraties die een meetkundige reeks vormen, worden gebruikt. Aanbevolen wordt vier replicaten voor iedere behandeling plus acht controles te gebruiken. De concentraties moeten worden gekozen met intervallen die onderling verschillen met een factor van niet meer dan 1,8.

Testduur en metingen

37

Op dag 28 worden de levende volwassen wormen geobserveerd en geteld. Alle ongebruikelijke gedragingen (bv. onvermogen om in de grond te graven, bewegingsloos tegen de glazen wand van het testvat liggen) en ongebruikelijke morfologie (bv. de aanwezigheid van open wonden) worden ook geregistreerd. Alle volwassen wormen worden vervolgens uit de testvaten verwijderd en geteld en gewogen. Het zoeken naar volwassen wormen kan makkelijker worden gemaakt door de grond met daarin de wormen vóór de beoordeling over te brengen naar een schone schaal. De uit de grond geëxtraheerde wormen moeten vóór het wegen worden gewassen (met gedeïoniseerd water) en het overtollige water moet worden verwijderd door de wormen kort op filterpapier te leggen. Wormen die op dat moment niet worden aangetroffen, moeten als dood worden geregistreerd, omdat moet worden aangenomen dat deze wormen vóór de beoordeling zijn overleden en ontbonden.

38

Als de grond uit de vaten is verwijderd, wordt deze weer terug in de vaten gebracht (zonder de volwassen wormen, maar met de eventuele cocons die zijn geproduceerd). De grond wordt vervolgens gedurende nog eens vier weken onder dezelfde testomstandigheden geïncubeerd, behalve dat enkel aan het begin van deze testfase voeding wordt verstrekt (zie punt 33).

39

Aan het eind van de tweede periode van vier weken wordt het aantal jonge wormen dat uit de cocons in de testgrond is gekomen, en het aantal cocons bepaald met de procedures als beschreven in aanhangsel 5. Gedurende de gehele testperiode moeten alle tekenen van letsel of beschadiging van de worm worden geregistreerd.

Limiettest

40

Als bij de hoogste concentratie in de bereikbepalingstest (d.w.z. 1000 mg/kg) geen effecten worden waargenomen, wordt de voortplantingstest uitgevoerd als een limiettest met 1000 mg/kg als testconcentratie. Een limiettest biedt de mogelijkheid om aan te tonen dat de NOEC voor de voortplanting groter is dan de hoogste concentratie, en om het aantal gebruikte wormen in de test tot een minimum te beperken. Zowel voor de behandelde grond als voor de controle moeten acht replicaten worden gebruikt.

Gegevens en rapportage

Verwerking van de resultaten

41

Hoewel aanhangsel 6 een overzicht bevat, wordt in deze testmethode geen definitieve statistische richtsnoer voor de analyse van de testresultaten gegeven.

42

Een van de eindpunten is de mortaliteit. Veranderingen in het gedrag (bv. onvermogen om in de grond te graven, bewegingsloos tegen de glazen wand van het testvat liggen) en de morfologie (bv. de aanwezigheid van open wonden) van de volwassen wormen moeten echter ook worden geregistreerd, evenals de aanwezigheid van eventuele nakomelingen. Normaal gesproken moet probit-analyse (18) of logistische regressie worden toegepast om de LC50 te bepalen. In gevallen waarin deze analysemethode niet geschikt is (bv. als er minder dan drie concentraties met gedeeltelijke sterfte beschikbaar zijn), kunnen echter andere methoden worden gebruikt. Tot deze methoden behoren onder andere voortschrijdende gemiddelden (19), de getrimde Spearman-Karber-methode (20) of eenvoudige interpolatie (bv. meetkundig gemiddelde van LC0 en LC100, berekend als de vierkantswortel van LC0 vermenigvuldigd met LC100).

43

Het andere eindpunt is de vruchtbaarheid (d.w.z. het aantal voortgebrachte nakomelingen). Net als in de bereik-bepalingstest moeten echter ook hier alle andere schadelijke tekenen worden geregistreerd in het eindverslag. De statistische analyse vereist dat het rekenkundig gemiddelde × en de standaardafwijking per behandeling en per controle voor de voortplanting worden berekend.

44

Als een variantieanalyse is uitgevoerd, kunnen de standaardafwijking (s) en het aantal vrijheidsgraden (df) worden vervangen door respectievelijk de schatting van de gepoolde variantie verkregen uit de ANOVA en haar aantal vrijheidsgraden, mits de variantie niet afhankelijk is van de concentratie. Gebruik in dit geval de afzonderlijke varianties van de controle en de behandelingen. Deze waarden worden doorgaans berekend door commerciële statistische software met de resultaten per vat als replicaten. Als het poolen van de gegevens voor de negatieve en oplosmiddelcontroles redelijk lijkt, in plaats van het toetsen tegen een hiervan, moeten ze worden getoetst om te bepalen of ze significant afwijken (zie punt 47 en aanhangsel 6 voor de geschikte toets).

45

De verdere statistische toetsen en gevolgtrekkingen hangen af van de vraag of de replicaatwaarden normaal verdeeld zijn en homogeen zijn voor wat betreft hun variantie.

Schatting van NOEC

46

De toepassing van krachtige toetsen heeft de voorkeur. Er dient gebruik te worden gemaakt van informatie uit bv. eerdere ervaring met ringtesten of andere historische gegevens over de vraag of gegevens ongeveer normaal verdeeld zijn. Homogeniteit van variantie (homoscedasticiteit) is crucialer. De ervaring leert dat de variantie vaak toeneemt bij een hoger gemiddelde. In deze gevallen zou een gegevenstransformatie kunnen leiden tot homoscedasticiteit. Een dergelijke transformatie moet echter worden gebaseerd op de ervaring met historische gegevens in plaats van op gegevens van het lopende onderzoek. Bij homogene gegevens moeten multipele t-toetsen zoals de Williams-toets (α = 0,05, eenzijdig) (21)(22) of in bepaalde gevallen de toets van Dunnett (23) (24) worden uitgevoerd. Er zij opgemerkt dat in het geval van ongelijke aantallen replicaten de tabel met t-waarden moet worden aangepast zoals voorgesteld door Dunnett en Williams. Soms nemen de responsen als gevolg van grote variatie niet regelmatig toe of af. In het geval van een sterke afwijking van monotoniciteit is de toets van Dunnett geschikter. Als er afwijkingen van homoscedasticiteit zijn, kan het redelijk zijn om mogelijke effecten op varianties nader te onderzoeken om te bepalen of de t-toetsen kunnen worden toegepast zonder al te zeer aan statistisch onderscheidingsvermogen in te boeten (25). Anders kan een multipele Mann-Whitney-toets, bv. de Bonferroni-toets volgens Holm (26), of wanneer deze gegevens heteroscedasticiteit vertonen maar anderszins consistent zijn met een onderliggende monotone dosis-respons, een andere verdelingsvrije toets (bv. Jonckheere-Terpstra (27) (28) of Shirley (29) (30)) worden toegepast, en deze zal doorgaans de voorkeur hebben boven t-toetsen voor ongelijke varianties. (Zie ook het schema in aanhangsel 6.)

47

Als een limiettest is uitgevoerd en er is voldaan aan de voorwaarden van parametrische toetsprocedures (normaliteit, homogeniteit), kan de gepaarde t-toets worden gebruikt, of anders de Mann-Whitney-toets (31).

Schatting van ECx

48

Om een ECx-waarde te berekenen worden de gemiddelden per behandeling gebruikt voor regressieanalyse (lineair of niet-lineair), nadat een passende dosis-responsfunctie is verkregen. Voor de groei van wormen als een continue respons kunnen ECx-waarden worden geschat met behulp van geschikte regressieanalyse (32). Tot de geschikte functies voor binaire gegevens (mortaliteit/overleving) en aantal geproduceerde nakomelingen behoren de normale sigmoïde, logistische of Weibull-functies, met twee tot vier parameters, waarvan sommige ook hormetische responsen kunnen modelleren. Als een dosis-responsfunctie werd gefit door lineaire regressieanalyse, moet bij de regressieanalyse een significante r2 (determinatiecoëfficiënt) en/of helling worden gevonden voordat de ECx kan worden geschat door in de door de regressieanalyse gevonden vergelijking een waarde in te vullen die overeenkomt met x % van het controlegemiddelde. De 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend overeenkomstig Fieller (geciteerd in Finney (18)) of andere passende moderne methoden.

49

De respons kan ook worden gemodelleerd als een percentage of proportie van de modelparameter die wordt geïnterpreteerd als de gemiddelde respons van de controle. In deze gevallen kan de normale (logistische, Weibull) sigmoïde curve vaak gemakkelijk aan de resultaten worden gefit met de probit-regressieprocedure (18). In deze gevallen moet de weegfunctie aan de metrische responsen worden aangepast zoals aangegeven door Christensen (33). Als echter hormese is waargenomen, moet probit-analyse worden vervangen door een logistische of Weibull-functie met vier parameters, die wordt gefit met een niet-lineaire regressieprocedure (34). Als geen geschikte dosis-responsfunctie aan de gegevens kan worden gefit, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om de ECx en de betrouwbaarheidsgrenzen te schatten, zoals voortschrijdende gemiddelden volgens Thompson (19) en de getrimde Spearman-Karber-methode (20).

Testverslag

50

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:
Teststof:
een ondubbelzinnige beschrijving van de teststof, batch, partij en CAS-nummer, zuiverheid;
eigenschappen van de teststof (bv. log Kow, oplosbaarheid in water, dampspanning, Henry-constante (H) en informatie over het lot en gedrag).
Testorganismen:
gebruikte testdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden;
leeftijd, grootte- (massa-) bereik van de testorganismen.
Testomstandigheden:
gegevens over de voorbereiding van de testgrond;
het maximale waterhoudend vermogen van de grond;
een beschrijving van de techniek die is gebruik voor het aanbrengen van de teststof op de grond;
gedetailleerde gegevens over hulpstoffen gebruikt bij de toediening van de teststof;
gegevens over de kalibratie van het sproeiapparaat, indien van toepassing;
beschrijving van de testopzet en procedure;
grootte van testvaten en volume van de testgrond;
testomstandigheden: lichtintensiteit, duur van licht-donkercycli, temperatuur;
een beschrijving van het voedingsschema, het type en de hoeveelheid voedsel dat in de test is gebruikt, voedingsdatums;
de pH en het watergehalte van de grond aan het begin en het eind van de test;
Testresultaten:
de mortaliteit van de volwassen wormen (%) in elk testvat aan het eind van de eerste 4 weken van de test;
de totale massa van de volwassen wormen aan het begin van de test in elk testvat;
veranderingen in lichaamsgewicht van de levende volwassen wormen (% van het begingewicht) in elk testvat na de eerste vier weken van de test;
het aantal geproduceerde nakomelingen in elk testvat aan het eind van de test;
een beschrijving van zichtbare of pathologische symptomen of opvallende veranderingen in het gedrag;
de resultaten verkregen met de referentieteststof;
de LC50, de NOEC en/of ECx (bv. EC50, EC10) voor de voortplanting als een of meer hiervan van toepassing zijn, met betrouwbaarheidsintervallen en een grafiek van het gefitte model dat is gebruikt voor de berekening ervan, en alle informatie en waarnemingen die van nut zijn voor de interpretatie van de resultaten;
een grafiek van de dosis-responsrelatie;
de resultaten die voor elk testvat gelden;
Afwijkingen van de procedures beschreven in deze testmethode en alle ongebruikelijke voorvallen tijdens de test.

Literatuur

(1)

Jaenicke, J. (1982). “Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4, 6-8.

(2)

Oien, N. & J. Stenerson (1984). Esterases of earthworm – III. Electrophoresis reveals that Eisenia foetida (Savigny) is two species. Verplicht Biochem. Physiol. 78c (2), 277 – 282.

(3)

Kula, C. (1996). Development of a test method on sublethal effects of pesticides on the earthworm species Eisenia fetida/Eisenia andrei – comparison of two ringtests. In: Riepert, F., Kula, C. (1996): Development of laboratory methods for testing effects of chemicals and pesticides on collembola and earthworms. Mitt. Biol. Bundesamst. f. Land- Forstwirtsch. Berlin-Dahlem, 320, blz. 50-82.

(4)

Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Acute toxiciteitstest voor regenwormen.

(5)

ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve.

(6)

ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve.

(7)

SETAC (1998). Advances in Earthworm Ecotoxicology. Sheppard, S.C., Bembridge, J.D., Holmstrup, M., & L. Posthuma, (eds). SETAC Press, 456 blz.

(8)

EPA (1996). Ecological effects test guidelines. Earthworm Subchronic Toxicity Test (850.62.00). United States Environmental Protection Agency. Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. EPA712-C-96-167, April 1996.

(9)

Bouché, M.B. (1972). Lombriciens de France, Ecologie et systématique. Publication de l'Institut National de la Recherche Agronomique.

(10)

Edwards, C.A. (1983). Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms. Report EUR 8714 EN, Commission of European Communities.

(11)

Greig-Smith, P.W., H. Becker, P.J. Edwards & F. Heimbach (eds.) (1992). Ecotoxicology of Earthworms. Intercept.

(12)

Edwards, C.A. & J. P. Bohlen, (1996). Biology and ecology of Earthworms, 3rd Edition. Chapman and Hall, London.

(13)

(ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve.

(14)

Hund-Rinke, K, Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81.

(15)

ISO (International Organization for Standardization) (1992). Soil Quality –Determination of water retention characteristics –Laboratory methods, No. 11274. ISO, Geneve.

(16)

ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality –Determination of dry matter and water content on a mass basis – Gravimetric method, No. 11465. ISO, Geneve.

(17)

Römbke, J. & Th. Moser (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150+ 223 blz.

(18)

Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), blz. 19-76. Cambridge Univ. Press.

(19)

Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London.

(20)

Hamilton, M.A., R.C. Russo & R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correctie Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417.

(21)

Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.

(22)

Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531.

(23)

Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121.

(24)

Dunnett, C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491.

(25)

Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361

(26)

Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70.

(27)

Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika 41, 133-145.

(28)

Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking. Indagationes Math. 14, 327-333.

(29)

Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies. Applied Statistics 28, 144-151.

(30)

Williams, D.A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control. Biometrics 42, 183-186.

(31)

Sokal, R.R. & F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York.

(32)

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ-mental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494

(33)

Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221.

(34)

Van Ewijk, P.H. & J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32.]

Aanhangsel 1.
Definities

[Voor de toepassing van deze testmethode worden de volgende definities gehanteerd:
Stof betekent een substantie of mengsel.
ECx (Effect concentration for x % effect) is de concentratie die binnen een bepaalde blootstellingstijd x % van een effect op testorganismen veroorzaakt ten opzichte van een controle. De EC50 is bijvoorbeeld de geschatte concentratie die gedurende een bepaalde blootstellingsperiode bij 50 % van een blootgestelde populatie een effect op een testeindpunt zal hebben. In deze test worden de effectconcentraties uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond of als een massa van de teststof per oppervlakte-eenheid van de grond.
LC0 (No lethal concentration) is de concentratie van een teststof die binnen een bepaalde blootstellingstijd geen van de blootgestelde testorganismen doodt. In deze test wordt de LC0 uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond.
LC50 (Median lethal concentration) is de concentratie van een teststof die binnen een bepaalde blootstellingstijd 50 % van de blootgestelde testorganismen doodt. In deze test wordt de LC50 uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond of als een massa van de teststof per oppervlakte-eenheid van de grond.
LC100 (Totally lethal concentration) is de concentratie van een teststof die binnen een bepaalde blootstellingstijd 100 % van de blootgestelde testorganismen doodt. In deze test wordt de LC100 uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) is de laagste concentratie van een teststof die tot een statistisch significant effect (p < 0,05) leidt. In deze test wordt de LOEC uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond of als een massa van de teststof per oppervlakte-eenheid van de grond. Alle geteste concentraties boven de LOEC moeten gewoonlijk een effect laten zien dat statistisch afwijkt van de controle. Alle afwijkingen van het bovenstaande moeten in het testverslag worden verantwoord.
NOEC (No Observed Effect Concentration) is de hoogste concentratie van de teststof direct onder de LOEC waarbij geen effect wordt waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de NOEC geen statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode in vergelijking met de controle.
Voortplantingssnelheid Is het gemiddelde aantal jonge wormen op een bepaald aantal volwassen wormen dat gedurende de testperiode wordt geproduceerd.
Teststof betekent alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.]

Aanhangsel 2.
Bepaling van het maximale waterhoudend vermogen van de grond

[De volgende methode voor de bepaling van het maximale waterhoudend vermogen van de grond is geschikt bevonden. Zij is beschreven in bijlage C van ISO DIS 11268-2 (1).
Verzamel met een geschikt bemonsteringsapparaat (grondboorbuis enz.) een vastgestelde hoeveelheid van het testgrondsubstraat (bv. 5 g). Bedek de onderkant van de buis met een stuk filterpapier, vul een waterbad en plaats de buis op een rek in het bad. De buis zou geleidelijk onder water moeten komen te staan, tot het water de bovenkant van de grond bereikt. Laat de buis gedurende ongeveer drie uur in het water. Niet alle water dat door de bodemcapil-lairen wordt geabsorbeerd, kan worden vastgehouden. Laat het grondmonster daarom gedurende twee uur uitlekken door de buis op een bed van zeer nat fijngemalen kwartszand in een afgesloten vat te plaatsen (om droging te voorkomen). Het monster moet vervolgens worden gewogen, gedroogd tot een constante massa bij 105 °C. Het waterhoudend vermogen (WHV) kan vervolgens als volgt worden berekend:
WHV (in % van droge massa) =
S – T – D
D
× 100
waarbij:
S = met water verzadigd substraat + massa van buis + massa van filterpapier
T = leeggewicht (massa van buis + massa van filterpapier)
D = droge massa van substraat

Literatuur

(1)

ISO International Organization for Standardization (Internationale Organisatie voor Normalisatie) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve.]

Aanhangsel 3.
Bepaling van de pH van de grond

[De volgende methode voor het bepalen van de pH van een grondmonster is gebaseerd op de beschrijving in ISO DIS 10390: Bodemkwaliteit – Bepaling van de pH-waarde (1).
Een vastgestelde hoeveelheid grond wordt gedurende ten minste 12 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens wordt een suspensie van de grond (die ten minste 5 g grond bevat) gemaakt in vijf keer zijn volume van hetzij een 1 M-oplossing van analytisch zuiver kaliumchloride (KCl) of een 0,01 M-oplossing van analytisch zuiver calcium-chloride (CaCl2). De suspensie wordt daarna vijf minuten goed geschud. Na het schudden krijgt de suspensie ten minste 2 uur, maar niet langer dan 24 uur, gelegenheid om te bezinken. Daarna wordt de pH van de vloeibare fase gemeten met een pH-meter die vóór elke meting is geijkt met een passende reeks bufferoplossingen (bv. pH 4,0 en 7,0).

Literatuur

(1)

ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve.]

Aanhangsel 4.
Kweken van Eisenia fetida/Eisenia andrei

[De kweek dient bij voorkeur plaats te vinden in een klimaatkamer bij 20 °C ± 2 °C. Bij deze temperatuur en bij voldoende voedselverstrekking zijn de wormen na ongeveer 2 tot 3 maanden volwassen.
Beide soorten kunnen worden gekweekt in een grote diversiteit aan dierlijke afvalstoffen. Het aanbevolen kweekmedium is een 50:50-mengsel van paarden- of koeienmest en turf. Er moeten controles plaatsvinden om te waarborgen dat koeien of paarden waarvan mest wordt verkregen, geen medicijnen gebruiken en niet worden behandeld met een chemische stof, zoals groeibevorderaars, nematiciden of soortgelijke diergeneesmiddelen die tijdens de test een negatief effect op de wormen zouden kunnen hebben. Het wordt aangeraden om zelfverzamelde mest van “biologische” oorsprong te gebruiken, want de ervaring leert dat commercieel verkrijgbare mest die als meststof in tuinen wordt gebruikt, negatieve effecten op de wormen kan hebben. Het medium moet een pH-waarde van ongeveer 6 tot 7 hebben (gereguleerd met calciumcarbonaat), moet een lage ionische geleidbaarheid hebben (minder dan 6 mS/cm of 0,5 % zoutconcentratie) en mag niet overmatig verontreinigd zijn met ammoniak of dierlijke urine. Het substraat dient vochtig maar niet te nat te zijn. Kweekbakken met een inhoud van 10 tot 50 liter zijn geschikt.
Om wormen met een standaardleeftijd en -grootte (-massa) te verkrijgen, kan de cultuur het beste worden begonnen met cocons. Wanneer de cultuur eenmaal is opgezet, wordt deze in stand gehouden door volwassen wormen gedurende 14 tot 28 dagen in een kweekbak met vers substraat te plaatsen om ze de gelegenheid te geven meer cocons te produceren. De volwassen wormen worden daarna verwijderd, en de jonge wormen die uit de cocons zijn gekomen, worden als basis voor de volgende cultuur gebruikt. De wormen worden voortdurend gevoed met dierlijke afvalstoffen en van tijd tot tijd overgeplaatst op vers substraat. De ervaring leert dat aan de lucht gedroogde, fijngemalen koeien- of paardenmest of havervlokken geschikte voedselbronnen zijn. Er moet worden gecontroleerd dat koeien of paarden waarvan mest wordt verkregen, geen medicijnen gebruiken en niet worden behandeld met een chemische stof, zoals groeibevorderaars, die tijdens een langlopende kweek een negatief effect op de wormen zouden kunnen hebben. De uit de cocons gekomen wormen worden voor de tests gebruikt wanneer ze 2 tot 12 maanden oud zijn en als volwassen worden beschouwd.
Wormen kunnen als gezond worden beschouwd als ze zich door het substraat voortbewegen, niet proberen om het substraat te verlaten en zich voortdurend voortplanten. Het substraat is uitgeput wanneer de wormen zich zeer traag voortbewegen en een geel achtereind hebben. In dat geval wordt aanbevolen vers substraat te verstrekken en/of het aantal dieren per bak te verlagen.]

Aanhangsel 5.
Technieken voor het tellen van uit cocons gekomen jonge wormen

[Het is heel tijdrovend om wormen uit het grondsubstraat met de hand te sorteren. Daarom worden twee alternatieve methoden aanbevolen.

(a)

De testvaten worden in een waterbad geplaatst met een temperatuur van aanvankelijk 40 °C, maar oplopend tot 60 °C. Na ongeveer 20 minuten moeten de jonge wormen op het grondoppervlak verschijnen, waar ze gemakkelijk van kunnen worden verwijderd en geteld.

(b)

De testgrond kan door een zeef worden gewassen met de methode die is ontwikkeld door Van Gestel et al. (1), mits de aan de grond toegevoegde turf en mest of havervlokken tot een fijn poeder zijn vermalen. Twee zeven (diameter 30 cm) met een maaswijdte van 0,5 mm worden op elkaar geplaatst. De inhoud van een testvat wordt onder een krachtige straal kraanwater door de zeven gewassen, zodat de jonge wormen en cocons hoofdzakelijk in de bovenste zeef achterblijven. Het is belangrijk op te merken dat tijdens deze handeling het gehele oppervlak van de bovenste zeef nat moet worden gehouden, zodat de jonge wormen op een film van water drijven en niet door de openingen van de zeef kunnen kruipen. Het beste resultaat wordt verkregen wanneer een douchekop wordt gebruikt.
Wanneer het grondsubstraat geheel door de zeef is weggewassen, kunnen de jonge wormen en cocons uit de bovenste zeef in een kom worden gespoeld. De inhoud van de kom krijgt daarna gelegenheid te rusten, zodat de lege cocons op het wateroppervlak komen drijven en de volle cocons en jonge wormen naar de bodem zinken. Het staande water kan vervolgens worden afgegoten en de jonge wormen en cocons kunnen worden overgebracht in een petrischaal met daarin een klein beetje water. De wormen kunnen met een naald of een pincet worden verwijderd om ze te tellen.
De ervaring leert dat methode (a) geschikter is voor de extractie van jonge wormen die mogelijk zelfs door een zeef met een maaswijdte van 0,5 mm worden weggewassen.
De efficiëntie van de gebruikte methode om de wormen (en cocons, in voorkomend geval) uit het grondsubstraat te verwijderen moet altijd worden bepaald. Als jonge wormen worden verzameld door ze handmatig te sorteren, is het raadzaam om de handeling op alle monsters twee keer uit te voeren.

Literatuur

(1)

Van Gestel, C.A.M., W.A. van Dis, E.M. van Breemen, P.M. Sparenburg (1988). Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. Pedobiologia 32:367-371.]

Aanhangsel 6.
Overzicht van de statistische beoordeling van gegevens (NOEC-bepaling)

[
]